Kjeldahlova metoda

Kjeldahlova metoda (kjeldahlizace) je analytická metoda stanovení přítomnosti dusíku v organických látkách. Metoda se skládá ze tří kroků - mineralizace, destilace a titrace. Při mineralizaci je dusík převeden na amoniak, ten je pak destilací oddělen od ostatních složek. Množství vzniklého amoniaku se určí titrací. Využití empirického vztahu mezi množstvím dusíku a bílkovinou obsaženou v organické látce pak umožňuje zjistit obsah bílkoviny ve vzorku.

Přestože jsou moderní metody rychlejší a efektivnější, žádná se nedokáže vyrovnat s rozmanitostí a velikostí vzorků jako původní metoda Johana Kjeldahla. Zejména v oblasti potravinářské chemie je stále zavedena jako referenční standard pro stanovení obsahu bílkovin.

V roce 1875 nastoupil dánský chemik Johan Kjeldahl do Carlsbergské laboratoře (Carlsberg Laboratory), která byla založena a podporována pivovarem Carlsberg. Jedním z jeho úkolů bylo určit množství bílkovin v obilí používaném ve sladovnickém průmyslu, neboť méně bílkovin znamenalo více piva.

Stávající metody analytické chemie související s bílkovinami nebyly v té době přesné. Johan Kjeldahl proto vyvinul metodu pro přesné stanovení dusíku ve vzorku, která se po něm nazývá . Je založená na rozkladu látky ve vroucí koncentrované kyselině sírové, neutralizaci a alkalizaci směsi, destilaci a stanovení amoniaku v destilátu pomocí titrace.

Johan Kjeldahl představil svou metodu Dánské chemické společnosti v roce 1883.

Během mineralizace (kjeldahlizace) se ke vzorku analyzované látky přidá kyselina sírová + peroxid vodíku nebo kyselina chloristá, případně katalyzátor (směs síranu měďnatého, selenu a síranu draselného). Vzorek se zahřívá na pískové lázni nebo elektrické plotně na velmi vysokou teplotu (asi 400 °C). Kyselina sírová při tom mineralizuje bílkoviny (obsah černá uhlíkem z organických látek), oxidační činidla převádějí uhlík na oxid uhličitý (mineralizovaná směs se odbarví). Odbarvení obsahu a husté bílé dýmy oxidu sírového avizují konec mineralizace. Dusík přítomný ve formě různých funkčních skupin se tak pomocí kyseliny sírové převede na síran amonný.

${\displaystyle \mathrm {(CH{\color {Blue}N}O)_{\ (Probe,\ s)}{\xrightarrow {\Delta ,\ H_{2}SO_{4\ (l)}}}\ CO_{2\ (g)}+SO_{2\ (g)}+H_{2}O_{\ (g)}+({\color {Blue}N}H_{4})_{2}SO_{4\ (solv)}} }$

Později byla používána i rutinní mineralizační metoda – vysrážené bílkoviny se mineralizovaly s kyselinou sírovou a vzniklý síran amonný se stanovil fotometricky při použití Nesslerova činidla (K₂[HgI₄] = HgI₂.2KI, tetrajodortuťnatan draselný), uvolněný amoniak reagoval za katalýzy nitroprussidem sodným s fenolovým činidlem (fenolátem sodným) Berthelotovou reakcí za vzniku modrého zbarvení vhodného k fotometrii.

Během destilace se přidáním hydroxidu sodného do směsi převádějí amonné ionty síranu amonného na plynný amoniak. Zvýšením teploty roztoku se amoniak mění na těkavý plyn, který stoupá v páře. Páry jsou zachyceny v roztoku, jako je například kyselina chlorovodíková nebo kyselina boritá.

${\displaystyle \mathrm {({\color {Blue}N}H_{4})_{2}SO_{4\ (solv)}+2\ NaOH_{\ (aq)}\longrightarrow Na_{2}SO_{4\ (aq)}+2\ {\color {Blue}N}H_{3}+2\ H_{2}O_{\ (l)}} }$

Amoniak zachycený v kyselině neutralizuje část kyseliny a snižuje tím pH roztoku. K roztoku kyseliny a amoniaku se proto přidává barvivo, které mění barvu při změně pH. Tento roztok se potom titruje zásadou (hydroxid sodný), dokud roztok nezmění barvu. Množství zásady potřebné k dosažení tohoto koncového bodu lze použít pro výpočet množství amoniaku v původním roztoku.

Využití empirického vztahu mezi množstvím dusíku stanoveného Kjeldahlovou metodou a bílkovinou obsaženou v organické látce umožňuje kvantifikovat obsah bílkovin ve vzorku. Je třeba vzít v úvahu, že jednotlivé aminokyseliny mají různý obsah dusíku, a proto i z nich složené bílkoviny se mohou lišit obsahem dusíku. To vedlo k definici konverzního faktoru, který je obvykle 6,25. Jeho hodnota vychází ze zjištění, že bílkoviny obsahují v průměru 16 % dusíku. Konverzní faktor se pak vypočítá podle rovnice 100/16 = 6,25.

Kjeldahlova metoda je obecně zdlouhavá a vyžaduje digestoř. Je to však stále standardní metoda, podle které jsou posuzovány všechny ostatní metody. Její univerzálnost, přesnost a reprodukovatelnost z ní učinily mezinárodně uznávanou metodu pro odhad obsahu bílkovin v potravinách. Používá se také k testování půd, odpadních vod, hnojiv a dalších materiálů.

Stanovení bílkovin krevního séra Kjeldahlovou metodou je komplikovanější, neboť v krvi jsou přítomny i dusíkaté látky nebílkovinného původu. Je proto zapotřebí stanovit celkový dusík v krvi, poté vysrážet bílkoviny, například kyselinou trichloroctovou a v supernatantu (tekutina nad sedimentem) stanovit dusík. Dusík bílkovin pak bude rozdílem mezi dusíkem celkovým a nebílkovinným: dusík plazmatických bílkovin = celkový dusík (plná krev) - nebílkovinný dusík (supernatant).

Kjeldahlova metoda není použitelná pro sloučeniny obsahující dusík v nitrosloučeninách, azoskupinách a cyklický dusík (například pyridin, chinolin, isochinolin), protože dusík těchto sloučenin se za podmínek této metody nepřeměňuje na síran amonný.

• Analytická chemie
• Dusík
• Aminokyseliny
• Bílkoviny

• Johan Kjeldahl: Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern. In: Zeitschrift für Analytische Chemie.1883, S. 366–382, doi:10.1007/BF01338151.
• R. Hoegger: Training Papers Nitrogen determination according to Kjeldahl. Büchi Labortechnik AG, Flawil 1998, S. 1–18.
• R. Bock: Aufschlussmethoden der anorganischen und organischen Chemie. Wiley-VCH, Weinheim 1972, ISBN 978-3527254033, S. 142–145.

V tomto článku byly použity překlady textů z článků Kjeldahl method na anglické Wikipedii a Kjeldahlsche Stickstoffbestimmung na německé Wikipedii.